一、检测原理
转氢酶-1（TH-1）位于线粒体内膜上，是呼吸电子传递链复合体六的关键成分，催化NADH+NADP⁺与NAD⁺+NADPH的相互转化。其中，正向反应（TH-1）将NADH转化为NADPH。由于NADH和NADPH在340nm有特征吸收，而TH-1催化的转氢反应不改变340nm吸光度，因此需使用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代NADP⁺。TH-1催化APADP⁺还原生成APADPH，后者在375nm有特征光吸收，通过测定375nm吸光度增加速率可计算TH-1活性。
二、试剂盒组成
- 核心试剂：
- 提取液：含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于提取样本中的TH-1。
- 试剂一：NADH溶液，作为反应底物。
- 试剂二：APADP⁺溶液，作为人工合成底物。
- 试剂三：稳定剂，用于稳定NADH和APADP⁺。
- 试剂四：激活剂，提高TH-1活性。
- 工作液：由试剂三、四、五混合溶解后配制，需临用前制备。
- 耗材：
- 1mL玻璃比色皿或96孔UV板。
- 离心管（1.5mL/10mL）。
- 一次性吸头。
- 研钵或组织匀浆器（用于组织样本）。
三、操作步骤
- 样本处理：
- 组织样本：称取0.1g组织，加入提取液冰浴匀浆，离心后取上清。
- 细胞样本：收集细胞后离心弃上清，加入提取液超声波破碎，离心后取上清。
- 血清/血浆样本：直接检测或按需稀释。
- 反应体系配制：
- 在比色皿或96孔板中加入样本和工作液，混匀后立即记录初始吸光值（A1）。
- 吸光度测定：
- 在375nm波长下测定反应一段时间后的吸光值（A2），计算ΔA=A2-A1。
四、结果计算
- 酶活力单位定义：
- 每克组织每分钟催化生成1μmol APADPH定义为一个酶活性单位（U/g鲜重）。
- 每毫克蛋白每分钟催化生成1μmol APADPH定义为一个酶活性单位（U/mg prot）。
- 计算公式：
- TH-1活性（U/g鲜重）= [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T
- TH-1活性（U/mg prot）= [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T
- 其中，V反总为反应体系总体积，ε为APADPH摩尔消光系数（6.7×10³ L/mol/cm），d为比色皿光径，W为样本质量，V样为反应体系中样本体积，V样总为加入提取液体积，Cpr为样本蛋白浓度，T为反应时间。
五、关键注意事项
- 样本处理：
- 样本需新鲜制备，避免TH-1失活。
- 组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活。
- 液体样本需避免溶血和细菌污染。
- 试剂使用：
- 工作液需临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
- 试剂含有毒性物质，避免直接用手接触。
- 不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线。
- 测定过程：
- 反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）。
- 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定，确保数据准确。
- 比色测定初始读数（0分钟读数）0.4左右为理想状态。
- 质量控制：
- 每次实验需设置空白对照和质控样本。
- 定期校准仪器，确保检测结果准确性。
- 若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确。
