鸡D-乳酸（D-LA）ELISA试剂盒

一、实验原理

鸡D-乳酸（D-LA）ELISA试剂盒通常采用竞争法或双抗体夹心法进行定量检测：

1. 竞争法：
   • 预包被抗D-LA抗体的微孔板中加入样本/校准品和HRP标记的D-LA抗原，形成固相抗体-酶标抗原复合物。
   • 未结合的组分被洗涤去除后，加入底物（TMB），HRP催化显色，终止液（2M硫酸）终止反应后，颜色由蓝变黄。
   • 吸光度（OD值）与样本中D-LA浓度呈负相关，通过标准曲线计算浓度。
2. 双抗体夹心法（部分试剂盒采用）：
   • 预包被捕获抗体的微孔板中加入样本，D-LA与捕获抗体结合。
   • 加入HRP标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-酶标抗体”夹心结构。
   • 显色后，OD值与样本中D-LA浓度呈正相关。

二、产品组成

试剂盒通常包含以下核心组件（以96孔配置为例）：

三、操作步骤汇总

以竞争法为例，操作流程如下：

1. 试剂准备：
   • 所有试剂和样本恢复至室温（18-25℃）。
   • 洗涤缓冲液稀释：蒸馏水按1:20稀释20×浓缩液。
   • 标准品稀释：按说明书梯度稀释（如0、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L）。
2. 加样与孵育：
   • 设置标准孔、样本孔和空白孔，每孔加入50μL标准品或10μL样本+40μL稀释液（稀释5倍）。
   • 每孔加入100μL HRP标记的检测抗体，封板膜封板，37℃孵育60分钟。
3. 洗涤：
   • 弃去液体，每孔加满洗涤液，静置1分钟后甩干，重复洗板5次。
4. 显色与终止：
   • 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟。
   • 每孔加入终止液50μL，15分钟内测定OD值（450nm波长）。
5. 结果计算：
   • 以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线（推荐四参数拟合）。
   • 样本浓度通过标准曲线换算，若样本稀释需乘以稀释倍数。

四、关键注意事项

1. 样本处理：
   • 血清/血浆：3000rpm离心10分钟取上清，避免溶血。
   • 组织匀浆：按1:9（重量:体积）加入PBS，充分匀浆后离心取上清。
   • 避免反复冻融，样本需分装保存。
2. 操作规范：
   • 洗板需 ，避免残留液体影响结果。
   • 显色时间根据实际颜色梯度调整（不超过30分钟）。
   • 终止液加入顺序与底物一致，避免颜色不均。
3. 结果判定：
   • 竞争法中OD值与浓度负相关，夹心法中正相关。
   • 若样本OD值高于标准曲线上限，需稀释后重新检测。
4. 储存条件：
   • 未开封试剂盒2-8℃保存，避免强光直射。
   • 酶标板开封后需密封保存，剩余试剂建议1个月内用完。

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