Human CBLB(E3 ubiquitin-protein ligase CBL-B) ELISA Kit
人CBLB(E3泛素-蛋白连接酶CBL-B)ELISA试剂盒
博研因赛生物生产的ELISA试剂盒采用抗体夹心法:将抗人CBLB抗体包被于酶标板上,标本和标准品中的人CBLB与抗体结合,加入生物素化的抗人CBLB抗体,再加入ABC复合物与生物素抗体结合,形成免疫复合物,然后加入TMB显色底物,显色剂显蓝色,最 后加终止液变黄色,游离的成分被洗去。在450 nm处测OD值,人CBLB浓度与OD值之间呈正比,可通过绘制标准曲线计算出标本中CBLB的浓度。
检测范围:78-5000pg/ml
灵敏度:46.9pg/ml
别名:CBLB/Signal transduction protein CBL-B/SH3-binding protein CBL-B/Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene b/RING finger protein 56

标本收集与试剂准备:

1、血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原,无内毒素试管(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可),血清、血浆避免使用溶血,***标本,标本悬浮物应离心去除,使标本清澈透明。待测样本应尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20℃或-80℃)保存,避免反复冻融。

2、洗涤液配置:用蒸馏水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水)

3、标准品配制:取7个1.5ml离心管,分别标注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64,blank。从第 一至七管中分别加入标准品/样品稀释液300ul。在第 一管中加入标准品溶液300ul(标准品浓度),置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出300ul,移至第 二管。如此反复作对倍稀释,从第六管中吸出300ul弃去,第七管为空白对照。(建议标准曲线使用以下浓度: 1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64,blank)。

4、生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟,用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液,根据所需用量配置,当日使用,剩余弃之。

5、ABC复合物工作液配置:使用前20分钟,用ABC复合物稀释液将100×浓缩ABC复合物稀释成1×工作液,当日使用,剩余弃之。

6、如果您的样本中检测物浓度高于标准品最 高值,建议重新检测,请根据实际情况,适当倍数稀释(建议做预实验,以确定稀释倍数)。

间接竞争ELISA法（最常用）：

固相包被：微孔板的孔壁上预包被了双酚A与载体蛋白（如卵清白蛋白OVA）偶联而成的包被抗原。

竞争性结合：检测时，向微孔中加入标准品或待测样品，并同时加入特异性的抗双酚A抗体。此时，样品中游离的双酚A与微孔板上预包被的包被抗原会竞争结合有限数量的抗双酚A抗体。

信号产生：孵育并洗涤后，加入酶标记物（通常是辣根过氧化物酶HRP标记的二抗，即抗抗体）。该酶标二抗会与已结合在板上的抗体（未被样品中双酚A占据的抗体）结合。再次孵育并洗涤后，加入TMB（四甲基联苯胺）底物溶液。

显色与检测：在酶的催化下，TMB底物显色（通常为蓝色）。样品中双酚A的浓度越高，与包被抗原竞争结合抗体的能力就越强，最终留在板上与酶标二抗结合的抗体就越少，显色后的颜色就越浅。

定量关系：加入终止液（通常为稀硫酸）终止反应，溶液由蓝色变为黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。样品的吸光度值与其所含的双酚A的含量成负相关。通过与一系列已知浓度的标准品比较，绘制标准曲线，即可计算出样品中双酚A的含量。

注意事项

温度控制：所有试剂和样本必须恢复至室温（20-25℃），否则会导致OD值偏低，影响结果准确性。

避免干燥：洗板过程中，严禁板孔干燥，否则会导致标准曲线线性差、重复性不好。拍干后应立即进行下一步操作。

充分混匀：每次加样和加试剂后都需充分混匀，否则重复性会变差。

精准操作：建议使用 的移液器，并为每个标准品和样品更换吸头，避免交叉污染。

避光操作：显色液对光敏感，显色过程需避光。

试剂有效期：不要使用过期试剂盒，不同批号的试剂不得混用。

安全防护：终止液为2M硫酸，具有腐蚀性；显色液可能对皮肤和 呼  吸 道 有刺激。操作时请佩戴手套、口罩和防护眼镜，避免接触皮肤和衣物。

样品稀释：若样品OD值高于标准曲线上限（即浓度过高），需用样品稀释液适当稀释后重测，计算时乘以相应的稀释倍数。

方法选择：请务必根据您所购试剂盒的说明书确认是“竞争法”还是“夹心法”，因为两者的标准曲线趋势（负相关 vs 正相关）和计算方式完全不同。以上步骤主要基于更常见的竞争法。

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