Human CD69(Early activation antigen CD69) ELISA Kit

人CD69(早期活化抗原CD69)ELISA试剂盒

检测范围:78-5000pg/ml

灵敏度:46.9pg/ml

别名:CD69(Early activation antigen CD69)/CLEC2C/EA-1/Leu23/MLR-3/p60/GP32/28/AIM/BL-AC/P26/EA1/CD69 antigen/Activation inducer molecule/activation inducer molecule(AIM/CD69)/CD69 molecule/C-type lectin domain family 2 member C/early activation antigen CD69/early lymphocyte activation antigen/Early T-cell activation antigen p60/Leukocyte surface antigen Leu-23  ？

保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。

• 标准规格酶标仪。
  
• 自动洗板机。
  
• 恒温箱。
  
• 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时， 用多通道移液器。
  
• 干净的试管和Eppendof管。
  
• 用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。

• 使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
  
• 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
  
• 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
  
• 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
  
• 禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
  
• 本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
  
• 揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出.

• 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少0.3mL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
  
• 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

• 细胞培养上清：离心去沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心1000×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 血浆：用干净试管收集，EDTA或肝素抗凝血液，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
  
• 悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的 检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

• 高：指待测因子在100～1000ng/ml。按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
  
• 中：指待测因子在10～100ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
  
• 低：指待测因子在156～10,000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
  
• 特低：指待测因子≤156pg/ml。样品一般不做稀释，或按1:2稀释。
• 
  
• 生物素标记抗人SIGLEC-1抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。
  
  • 根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100～200μL）。
    
  • 按1μL生物素标记抗人SIGLEC-1加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
• 亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
  
  • 根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100～200μL）。
    
  • 按1μL亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。

已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

• 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
  
• 将10,000pg/ml，5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，每孔加100μL已用样品稀释液稀释的样品。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
  
• 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
  
• 将准备好的生物素抗人SIGLEC-1抗体工作液按每孔100μL依次加入。（TMB空白显色孔除外），
• 酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
  
• 1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
  
• 将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
  
• 1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
  
• 按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟。
  注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异， 显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
  
• 按每孔100μL依次加入终止液，顺序同加TMB。此时蓝色立转黄色。
  
• 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
  有两种设定空白对照的方案：
  ① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
  ② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
  
• 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

• 加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
  
• 加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
  
• 加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
  
• TMB 37℃反应15～20分钟。
  
• 加入终止液，读数。

1、在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测,每次检测都应做标准曲线。

2、洗涤过程很关键,洗涤不充分将导致 度误差及OD值错误地升高,从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能 有结晶,属于正常现象,37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

3、检测时所有试剂都要恢复到室温,板条开封后剩余板条需封好,放回袋中2个月内用完。

4、试剂盒使用超敏TMB溶液,若显色过深会出现絮状物,属正常现象,不影响结果判读。

仅用于科研,不能用于临床诊断!

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