Human CLPP(Putative ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, mitochondrial) ELISA Kit

人CLPP(假定ATP依赖的Clp蛋白酶蛋白水解亚基,线粒体)ELISA试剂盒

检测范围:1.56-100ng/ml

灵敏度:0.938ng/ml

别名:CLPP/Endopeptidase Clp

一、 实验前准备与试剂配制

1. 试剂平衡与处理：试剂盒使用前应保存在2-8℃。除复溶后的标准品外，其他成分不可冻结。实验开始前，需将各种试剂移至室温（18-25℃）平衡至少30分钟。若浓缩洗涤液有结晶析出，可在水浴中加温助溶，待结晶完全溶解后再进行稀释配制。
2. 试剂混匀与离心：浓缩抗体或酶结合物在运输中可能附着于管壁或瓶盖，使用前需用手甩几下或1000rpm离心1分钟，使液体沉积到管底。配制试剂时需用旋涡混合仪混匀，尽量避免起泡。
3. 标准品配制：冻干标准品为一次性使用，溶解两小时后会迅速失活，切勿分装。建议临用前15分钟内配制，采用倍比稀释法配制标准品梯度，且稀释请勿在酶标板中进行。

二、 标本收集与处理

1. 血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取上清液立即测试。
2. 血浆：使用EDTA、枸橼酸钠或肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm离心10分钟，取上清液立即测试。
3. 组织匀浆：切取组织块在PBS中过洗，按1g组织加入5-10ml组织蛋白萃取试剂的比例在冰水中匀浆。完成后5000-10000rpm离心10分钟，取上清液。
4. 细胞培养上清/尿液等：1000-3000rpm离心10分钟，去除悬浮物及细胞碎片，取上清液备用。
5. 保存原则：标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃或-80℃冰箱内，避免反复冻融。

三、 核心操作步骤（双抗体夹心法）

1. 加样与一抗孵育：分别设置标准品孔和待测样本孔，每孔加入标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀。覆上板贴，置于37℃温育2小时。
2. 加生物素标记抗体：弃去孔内液体并甩干（此步不用洗涤）。每孔加入100μL生物素标记抗体工作液，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
3. 洗板：弃去孔内液体，甩干，进行洗板3次。每次加入200μL洗涤液浸泡2分钟，倒掉后在吸水纸上拍干去除残留液体。
4. 加酶结合物与孵育：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记亲和素工作液，37℃温育30分钟（需避光）。随后再次洗板3次。
5. 显色与终止：每孔加入100μL底物溶液（如TMB），37℃避光孵育30分钟，液体呈梯度蓝色。 每孔加入100μL终止液（如2M硫酸），反应终止后孔内液体呈橙黄色。

四、 结果读取与数据分析

1. 酶标仪读数：试验结果判定必须以酶标仪读数为准。使用双波长检测时，波长应设置为450nm和630nm。需在终止反应后30分钟内完成检测。
2. 浓度计算：以标准品浓度为横坐标（X轴），对应的OD值为纵坐标（Y轴），在软件中绘制标准曲线并拟合出公式。将样本的OD值代入公式计算出稀释液浓度， 乘以相应的稀释倍数，得出样本中CLPP的实际浓度。

五、 注意事项

1、在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测,每次检测都应做标准曲线。

2、洗涤过程很关键,洗涤不充分将导致 度误差及OD值错误地升高,从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能 有结晶,属于正常现象,37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

3、检测时所有试剂都要恢复到室温,板条开封后剩余板条需封好,放回袋中2?个月内用完。

4、试剂盒使用超敏TMB溶液,若显色过深会出现絮状物,属正常现象,不影响结果判读。

5、仅用于科研,不能用于临床诊断!

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