Human CK-20/KRT20(Cytokeratin 20) ELISA Kit

人CK-20/KRT20(细胞角蛋白20)ELISA试剂盒

一、 试剂盒核心参数与原理

• 检测原理：采用双抗体夹心法。微孔板预包被抗人CK-20/KRT20抗体，样本中的靶蛋白与固相抗体结合后，加入HRP标记的抗体形成复合物， 通过TMB底物显色。颜色的深浅与样本中CK-20浓度呈正相关，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。
• 检测范围与灵敏度：常见检测范围在 0.625 ng/mL - 40 ng/mL 之间，灵敏度（ 检出剂量）通常低于 0.156 ng/mL。
• 适用样本：血清、血浆（EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝）、组织匀浆、细胞培养上清、尿液等。
• 质控指标：批内变异系数（CV）通常小于8%，批间CV小于10%。

二、 实验前准备与样本处理

1. 试剂平衡：试剂盒应保存在2-8℃。实验前需提前15-30分钟将所有试剂和标本平衡至室温。若30倍浓缩洗涤液有结晶析出，需在水浴中加温助溶，待结晶完全溶解后再进行稀释。
2. 样本制备：
   • 血清：使用不含热原和内毒素的试管收集血液，操作过程中避免细胞刺激。3000转离心10分钟，将血清与红细胞迅速小心分离。
   • 血浆：使用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟，取上清液。
   • 细胞上清液/组织匀浆：3000转离心10分钟，去除颗粒和聚合物，取上清液。
3. 保存原则：样本收集后应尽早进行提取和实验。若不能立即检测，需按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融。
4. 关键禁忌：样本中不能含有叠氮化钠（NaN3），因为NaN3会抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性，导致检测失败。

三、 核心实验操作步骤（双抗体夹心法）

1. 加样与孵育：设置空白孔、标准品孔和待测样本孔。标准品孔加入50μL标准品；样本孔先加40μL样品稀释液，再加10μL待测样本（样品最终稀释度为5倍）。加样时尽量加于孔底部，轻轻晃动混匀。覆上封板膜，37℃温育30分钟。
2. 洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体并甩干。每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次， 在吸水纸上拍干。
3. 加酶标试剂：除空白孔外，每孔加入50μL酶标试剂。覆上封板膜，37℃温育30分钟。
4. 再次洗板：重复上述洗板操作5次，并拍干。
5. 显色与终止：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 每孔加入50μL终止液，反应终止后液体颜色由蓝变黄。

注意事项:

1、在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测,每次检测都应做标准曲线。

2、洗涤过程很关键,洗涤不充分将导致 度误差及OD值错误地升高,从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能 有结晶,属于正常现象,37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

3、检测时所有试剂都要恢复到室温,板条开封后剩余板条需封好,放回袋中2?个月内用完。

4、试剂盒使用超敏TMB溶液,若显色过深会出现絮状物,属正常现象,不影响结果判读。

5、仅用于科研,不能用于临床诊断!

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