双酚S（Bisphenol S, BPS）作为双酚A（BPA）的常见替代品，其潜在的 内 分 泌 干扰效应也日益受到关注。ELISA法因其高灵敏度和高通量，成为检测环境和食品中BPS残留的重要工具。

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一、 检测原理

双酚S作为小分子化合物（半抗原），其ELISA检测普遍采用间接竞争ELISA方法。其核心原理如下：

1. 固相包被：微孔板的孔壁上预包被了双酚S与载体蛋白（如卵清白蛋白OVA）偶联而成的包被抗原（BPS-OVA）。
2. 竞争性结合：检测时，向微孔中加入标准品或待测样品，并同时加入特异性的抗双酚S抗体。此时，样品中游离的双酚S与微孔板上预包被的包被抗原会竞争结合有限数量的抗双酚S抗体。
3. 信号产生：孵育并洗涤后，加入酶标记物（通常是辣根过氧化物酶HRP标记的二抗，即抗抗体）。该酶标二抗会与已结合在板上的抗体（未被样品中双酚S占据的抗体）结合。再次孵育并洗涤后，加入TMB（四甲基联苯胺）底物溶液。
4. 显色与检测：在酶的催化下，TMB底物显色（通常为蓝色）。样品中双酚S的浓度越高，与包被抗原竞争结合抗体的能力就越强，最终留在板上与酶标二抗结合的抗体就越少，显色后的颜色就越浅。
5. 定量关系：加入终止液（通常为稀硫酸）终止反应，溶液由蓝色变为黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。样品的吸光度值与其所含的双酚S的含量成负相关。通过与一系列已知浓度的标准品比较，绘制标准曲线，即可计算出样品中双酚S的含量。

核心特点：

• 灵敏度高：检测限（LOD）通常可达0.1-0.5 ppb (μg/kg)，能满足严格的残留限量要求。
• 特异性好：高质量的单克隆抗体能有效区分双酚S与其他结构类似的化学物质（如双酚A、双酚F等）。
• 高通量：96孔板的设计可同时检测大量样品。

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二、 产品组成

一个典型的96孔双酚S间接竞争ELISA试剂盒通常包含以下组分：

1. 核心试剂：

• 预包被酶标板：1块（12条×8孔），孔内已包被双酚S-OVA偶联抗原。
• 双酚S标准品：6瓶（1ml/瓶），通常为一系列浓度的溶液，如0 ppb, 0.5 ppb, 1.5 ppb, 4.5 ppb, 13.5 ppb, 40.5 ppb（具体浓度因厂家而异）。
• 抗体工作液：1瓶（5.5-6ml），特异性抗双酚S抗体（可能为浓缩液，需稀释）。
• 酶标记物：1瓶（6-11ml），通常为HRP标记的二抗。
• 显色液：A液和B液各1瓶（各6ml），混合后为TMB底物。
• 终止液：1瓶（6ml），通常为2M硫酸溶液。
• 浓缩洗涤液：1瓶（40ml），通常为20倍浓缩，需稀释后使用。
• 样本复溶液/稀释液：1瓶（50ml），用于稀释样品和标准品。

2. 辅助材料：

• 盖板膜：1张
• 自封袋：1个（用于保存未用完的板条）
• 说明书：1份

3. 所需仪器与耗材（通常需自备）：

• 酶标仪（具备450nm滤光片，建议有630nm参比波长）
• 精密移液器（单道和多道）及枪头
• 恒温振荡器或水浴锅（37℃）
• 离心机
• 氮吹仪或真空浓缩仪
• 天平（感量0.01g）
• 去离子水或蒸馏水

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三、 产品步骤汇总

以下为通用的间接竞争ELISA操作步骤，具体请以所购试剂盒的说明书为准。

阶段：准备工作

1. 试剂平衡：将所有试剂从2-8℃或-20℃冰箱中取出，置于室温（20-25℃）下平衡至少30分钟。使用前需轻轻摇匀，尤其是液体试剂。
2. 配制工作液：
   • 洗涤液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液按1:19的比例稀释（例如: 1ml 浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）。若有晶体析出，需在37℃下加热至晶体全部溶解。
   • 标准品应用液：用样本复溶液将高浓度标准品逐级稀释成一系列工作浓度（如0, 0.5, 1.5, 4.5, 13.5, 40.5 ppb）。
   • 抗体及酶标二抗工作液：根据说明书要求，用1×稀释液将浓缩的抗体和酶标二抗稀释成1×工作液（例如，100×浓缩液取1份加99份稀释液）。
3. 样品前处理（此步骤至关重要，根据样品类型选择）：
   • 粮食/饲料：粉碎后取5g样品，加入25ml 40%乙醇水，剧烈震荡10分钟，离心后取上清，再用1×PBS稀释20倍后检测。
   • 食用油：称取2g样品，用正己烷和PBS液液萃取，取下层水相，再用甲醇和水稀释后检测。
   • 塑料制品：称取样品，用二氯甲烷超声提取，甲醇萃取，吹干后用有机溶剂复溶并用水稀释定容。
   • 水基食品/饮料：取上清液，离心或调节pH后用固相萃取小柱净化，洗脱后吹干复溶。
   • 所有样本最终需用复溶液稀释一定倍数，以使其浓度落在标准曲线范围内。

阶段：实验操作

1. 编号：在微孔板架上标记标准品、样品和空白孔的位置，建议每个标准品和样品做2-3个平行孔。
2. 加样（竞争反应）：
   • 向相应微孔中加入50μL的标准品应用液或处理好的样品溶液。
   • 紧接着向所有孔（除空白孔外）加入50μL的抗体工作液。
   • 轻轻振荡混匀，用盖板膜封板。
3. 次孵育：将酶标板置于37℃恒温环境中，避光反应30分钟。
4. 洗涤：
   • 揭开盖板膜，甩干孔内液体。
   • 用洗涤液注满各孔，静置15-30秒后弃去，重复洗涤3次。
   • 一次在吸水纸上拍干，确保无液体残留。
5. 加酶标记物：向所有孔中加入100μL的酶标记物（HRP-二抗）工作液。轻轻混匀，封板。
6. 次孵育：置于37℃恒温环境中，避光反应30分钟。
7. 再次洗涤：重复步骤4的洗涤过程， 洗去未结合的酶标记物，建议洗涤4次。
8. 显色：
   • 向每孔首先加入底物液A液50μL，再加B液50μL。
   • 轻轻振荡混匀，封板，于37℃下避光显色10-15分钟（具体时间视颜色深浅而定，标准品 浓度孔应呈现极浅蓝色）。
9. 终止反应：向每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，溶液由蓝色变为黄色。

第三阶段：读数与结果计算

1. 测定OD值：在加入终止液后5-10分钟内，使用酶标仪在450nm波长下（建议使用630nm作为参比波长）测定各孔的吸光度（OD值）。
2. 数据有效性判断：
   • 0标准品（ 浓度点）的OD值应大于0.5，否则可能试剂失效。
   • 标准品的OD值应随浓度增加而递减。
3. 结果计算：
   • 计算百分吸光度：百分吸光度(%) = (B / B₀) × 。其中，B为样品或标准品的平均OD值，B₀为0浓度标准品的平均OD值。
   • 绘制标准曲线：以标准品的百分吸光度为纵坐标，以对应的双酚S浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制半对数坐标曲线（或使用专业软件拟合四参数逻辑曲线）。
   • 计算样品浓度：将样品的百分吸光度代入标准曲线，查得对应的浓度值，再乘以样品的稀释倍数，即为样品中双酚S的实际浓度。

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四、 注意事项

1. 温度控制：所有试剂和样本必须恢复至室温（20-25℃），否则会导致OD值偏低，影响结果准确性。
2. 避免干燥：洗板过程中，严禁板孔干燥，否则会导致标准曲线线性差、重复性不好。拍干后应立即进行下一步操作。
3. 充分混匀：每次加样和加试剂后都需充分混匀，否则重复性会变差。
4. 精准操作：建议使用 的移液器，并为每个标准品和样品更换吸头，避免交叉污染。
5. 避光操作：显色液对光敏感，显色过程需避光。
6. 试剂有效期：不要使用过期试剂盒，不同批号的试剂不得混用。
7. 安全防护：终止液为2M硫酸，具有腐蚀性；显色液可能对皮肤和 呼 吸 道 有刺激。操作时请佩戴手套、口罩和防护眼镜，避免接触皮肤和衣物。
8. 样品稀释：若样品OD值高于标准曲线上限（即浓度过高），需用样品稀释液适当稀释后重测，计算时乘以相应的稀释倍数。