氮哌酮（AZP）ELISA试剂盒

一、检测原理

氮哌酮（AZP）ELISA试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附法，其核心原理如下：

1. 抗原-抗体竞争结合：
   • 酶标板微孔中预包被氮哌酮（AZP）的偶联抗原（AZP与载体蛋白结合的复合物）。
   • 样本中的游离AZP与预包被的偶联抗原竞争结合AZP特异性抗体（一抗）。
   • 游离AZP浓度越高，结合到固相抗原上的抗体越少。
2. 酶催化显色反应：
   • 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已结合到固相抗原上的一抗结合，形成“包被抗原-一抗-酶标二抗”复合物。
   • 加入TMB底物，HRP催化TMB生成蓝色产物，加入终止液（稀硫酸）后，蓝色变为黄色。
   • 颜色深浅与样本中AZP浓度成反比：AZP浓度越高，竞争结合的抗体越少，显色越浅；反之则显色越深。
3. 定量分析：
   • 通过酶标仪测定450nm波长下的吸光度值（OD值），绘制标准曲线（以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标），计算样本中AZP的实际浓度。

二、产品组成

试剂盒通常包含以下核心组件（以96孔配置为例）：

三、操作步骤

以间接竞争法为例，典型操作流程如下：

1. 试剂准备：
   • 将所有试剂和样本恢复至室温（18-25℃）。
   • 浓缩洗涤液按1:20稀释（如1mL浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水）。
   • 标准品配制：用样品稀释液将1000 ppb标准品逐级稀释至6个浓度（16 ppb、8 ppb、4 ppb、2 ppb、1 ppb、0.5 ppb），零浓度标准品用样品稀释液代替。
   • 一抗和酶标二抗工作液：按说明书要求用稀释液稀释至工作浓度。
2. 加样与孵育：
   • 标准品孔：每孔加入50μL不同浓度的标准品。
   • 样本孔：每孔加入40μL样品稀释液+10μL待测样本（稀释5倍）。
   • 空白孔：不加样本及酶标试剂，其余操作相同。
   • 每孔加入50μL一抗工作液，封板膜封板，37℃避光孵育30分钟。
3. 洗涤：
   • 弃去孔内液体，每孔加入300μL洗涤缓冲液，静置30秒后弃去，重复洗涤3次，拍干。
4. 二抗孵育：
   • 每孔加入100μL酶标二抗工作液，封板膜封板，37℃避光孵育30分钟。
   • 重复洗涤步骤4次。
5. 显色与终止：
   • 每孔加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻混匀，37℃避光显色15分钟。
   • 每孔加入50μL终止液，轻轻混匀，蓝色立转黄色。
6. 测定与计算：
   • 15分钟内用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。
   • 以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算样本中AZP的实际浓度（乘以稀释倍数）。

四、关键注意事项

1. 样本处理：
   • 血清/血浆样本需离心后取上清，避免溶血和 高 血 脂 样本。
   • 组织匀浆需用PBS匀浆后离心取上清。
2. 操作规范：
   • 洗板需 ，避免残留液体影响结果。
   • 显色时间严格控制（通常10-15分钟），避免颜色过深或过浅。
   • 终止液加入顺序与显色液一致，保证反应同步终止。
3. 结果判定：
   • 若样本OD值高于标准曲线上限，需稀释后重新检测。
   • 所有结果以酶标仪读数为准，避免肉眼判断误差。
4. 储存条件：
• 未开封试剂盒保存于2-8℃，开封后组分按说明书条件保存。
• 酶标板开封后未用完，需装入密封袋，2个月内用完。

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