昆虫多巴胺（DA）检测试剂盒

一、实验原理

昆虫多巴胺（DA）检测试剂盒主要基于双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），部分试剂盒采用竞争法原理：

1. 双抗体夹心法：
   • 预包被抗DA特异性抗体于微孔板，形成固相载体。
   • 加入样本或标准品，其中的DA与固相抗体结合。
   • 加入HRP标记的抗DA检测抗体，形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”复合物。
   • 洗涤去除未结合组分后，加入底物（如TMB），HRP催化底物显蓝色，终止液（如硫酸）终止反应后转为黄色。
   • 颜色深浅与样本中DA浓度正相关，通过酶标仪测定450nm波长下的吸光度（OD值），计算浓度。
2. 竞争法（部分试剂盒）：
   • 微孔板包被DA类似物或结合蛋白，样本中的DA与酶标记的DA竞争结合有限抗体位点。
   • 样本中DA浓度越高，与抗体结合的酶标DA越少，显色后OD值与DA浓度负相关。

二、产品组成

试剂盒通常包含以下核心组件（以96孔配置为例）：

三、操作步骤

以双抗体夹心法为例，操作流程如下：

1. 试剂准备：
   • 所有试剂和样本恢复至室温（18-25℃）。
   • 浓缩洗涤液按1:20稀释（如25mL浓缩液+475mL蒸馏水）。
   • 标准品稀释：按说明书梯度稀释（如120 pg/mL→60 pg/mL→30 pg/mL→…→0 pg/mL）。
2. 加样：
   • 设置标准品孔、样本孔和空白孔。
   • 标准品孔：每孔加入50μL不同浓度的标准品。
   • 样本孔：每孔加入40μL样本稀释液+10μL待测样本（最终稀释度为5倍）。
   • 空白孔：不加样本及酶标试剂。
3. 温育：
   • 用封板膜封板，37℃孵育60分钟。
4. 洗涤：
   • 弃去液体，每孔加满洗涤液，静置1分钟后甩去，重复洗板5次，拍干。
5. 加酶：
   • 每孔加入100μL HRP标记的检测抗体（空白孔除外）。
   • 37℃孵育60分钟。
6. 洗涤：
   • 重复步骤4，洗板5次。
7. 显色：
   • 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟。
8. 终止：
   • 每孔加入50μL终止液，蓝色立转黄色。
9. 测定：
   • 15分钟内，用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。
   • 以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算样本浓度（乘以稀释倍数）。

四、关键注意事项

1. 样本处理：
   • 血清/血浆：离心后取上清，避免溶血。
   • 组织匀浆：称取组织后加入PBS（pH7.4），匀浆后离心取上清。
   • 细胞上清：离心后取上清，避免细胞碎片干扰。
2. 操作规范：
   • 洗板需 ，避免残留液体影响结果。
   • 显色时间严格控制（通常10-15分钟），避免颜色过深或过浅。
   • 终止液加入顺序与显色液一致，保证反应同步终止。
3. 结果判定：
   • 若样本OD值高于标准曲线上限，需稀释后重新检测。
   • 避免使用含NaN₃的样本，因其会抑制HRP活性。
4. 储存条件：
   • 未开封试剂盒保存于2-8℃，开封后组分按说明书条件保存。
   • 酶标板开封后未用完，需装入密封袋保存。

五、相关产品推荐