兔糖胺聚糖（GAG）ELISA试剂盒

一、实验原理

兔糖胺聚糖（GAG）ELISA试剂盒基于双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），核心步骤如下：

1. 固相抗体包被：酶标板微孔预先包被抗兔GAG的特异性捕获抗体。
2. 抗原结合：加入待测样本（如血清、血浆）或标准品，样本中的GAG与固相抗体结合。
3. 酶标抗体结合：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗GAG检测抗体，形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”复合物。
4. 显色反应：洗涤后加入底物TMB，HRP催化TMB显蓝色，酸终止后转为黄色。颜色深浅与GAG浓度正相关。
5. 定量分析：酶标仪测定450nm波长下的吸光度（OD值），通过标准曲线计算样本中GAG浓度。

二、产品组成

试剂盒通常包含以下核心组件（以96孔配置为例）：

三、操作步骤

以双抗体夹心法为例，操作流程如下：

1. 试剂准备
   • 所有试剂和样本恢复至室温（18-25℃）。
   • 浓缩洗涤液按1:25稀释（如20mL浓缩液+480mL蒸馏水）。
   • 标准品稀释：按说明书梯度稀释（如250 ng/mL→125 ng/mL→62.5 ng/mL→…→0 ng/mL）。
2. 加样
   • 设置标准品孔、样本孔和空白孔。
   • 标准品孔：每孔加入50μL不同浓度的标准品。
   • 样本孔：每孔加入40μL样品稀释液，再加入10μL待测样本（最终稀释度为5倍）。
   • 空白孔：不加样本及酶标试剂，其余操作相同。
3. 温育
   • 用封板膜封板，37℃孵育30分钟。
4. 洗涤
   • 弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗板5次，拍干。
5. 加酶
   • 每孔加入酶标试剂50μL（空白孔除外），37℃孵育30分钟。
6. 洗涤
   • 重复步骤4，洗板5次。
7. 显色
   • 每孔加入显色剂A、B各50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
8. 终止
   • 每孔加入终止液50μL，蓝色立转黄色（15分钟内测定OD值）。
9. 测定
   • 以空白孔调零，450nm波长下测定各孔OD值。
   • 根据标准曲线计算样本浓度（乘以稀释倍数5倍）。

四、关键注意事项

1. 样本处理
   • 血清/血浆：离心后取上清，避免溶血。
   • 组织匀浆：按1:9（重量:体积）加入PBS，匀浆后离心取上清。
   • 细胞上清液：离心后取上清，避免细胞碎片干扰。
2. 操作规范
   • 洗板需 ，避免残留液体影响结果。
   • 显色时间严格控制（通常10-15分钟），避免颜色过深或过浅。
   • 终止液加入顺序与显色液一致，保证反应同步终止。
3. 结果判定
   • 若样本OD值高于标准曲线上限，需稀释后重新检测。
   • 避免使用含NaN₃的样本，因其会抑制HRP活性。
4. 储存条件
   • 未开封试剂盒2-8℃保存，避免反复冻融。
   • 酶标板开封后需密封保存，剩余试剂建议1个月内用完。