转氢酶（TH）位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，它催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互转化，从而其中，逆向反应被称为TH-2，它催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。转氢酶-2在能量代谢、氧化应激等生理过程中发挥着重要作用。

测定原理

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，但TH催化的转氢反应并不能导致340nm吸光度的变化。因此，测试盒采用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺还原生成APADH，而APADH在375nm有特征光吸收。通过测定375nm光吸收的增加速率，可以计算出TH-2的活性。

试剂组成和配制

转氢酶-2测试盒通常包含以下试剂：

• 试剂一：液体，含碱性提取液，用于提取样本中的转氢酶，通常保存于-20℃。
• 试剂二：液体，含NADPH溶液，作为反应底物，通常保存于-20℃。
• 试剂三：液体，含APAD⁺溶液，作为人工合成反应底物，通常保存于4℃。
• 试剂四：粉剂，含激活剂，用于提高转氢酶活性，通常保存于-20℃。
• 试剂五：粉剂，含稳定剂，用于稳定反应体系，通常保存于-20℃。

样本前处理

样本前处理步骤通常包括：

1. 组织样本：准确称取一定量的组织（如0.1g），加入适量的试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。然后，通过低速离心和高速离心去除杂质和胞浆蛋白，得到线粒体沉淀。
2. 细胞样本：收集一定量的细胞（如500万细胞），离心后弃上清。加入适量的试剂一，超声波破碎细胞。然后，通过离心去除杂质，得到裂解液。
3. 血清/血浆样本：血清/血浆样本可直接检测；若浓度过高，可用提取液稀释后检测。

测定步骤

测定步骤通常包括：

1. 仪器预热：分光光度计预热30分钟以上，调节波长至375nm，用蒸馏水调零。
2. 工作液配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于适宜温度（如37℃）水浴5分钟。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3. 样本测定：在比色皿中加入适量的样本和工作液，混匀后立即记录初始吸光值A1和一定时间后的吸光值A2（如10分钟后），计算ΔA=A2-A1。