一、检测原理

Na⁺/K⁺-ATP酶广泛分布于动植物细胞、微生物及细胞器中，其核心功能是催化ATP水解生成ADP和无机磷（Pi）。测试盒通过分光光度法定量测定反应体系中无机磷的含量，间接反映酶活性。关键步骤包括：

1. 酶促反应：样本中的Na⁺/K⁺-ATP酶分解ATP，释放无机磷。
2. 显色反应：无机磷与定磷剂（如钼酸铵复合物）反应生成蓝色产物，颜色深浅与磷浓度成正比。
3. 吸光度测定：在660nm波长下测量显色液的吸光度，通过标准曲线计算酶活性。

二、试剂盒组成

• 核心试剂：
  • 提取液（用于样本匀浆或细胞裂解）
  • 酶反应缓冲液（含ATP、Mg²⁺等）
  • 标准磷溶液（用于绘制标准曲线）
  • 定磷剂（现用现配，避免磷污染）
• 辅助试剂：
  • 粉剂型试剂（需按说明书溶解后使用，部分需-20℃保存）
  • 洗涤液（用于去除未结合成分）
• 耗材：
  • 1mL玻璃比色皿（适配分光光度计）
  • 研钵（组织匀浆用）
  • 离心管、移液器枪头等

三、操作步骤（通用流程）

1. 样本制备：
   • 组织样本：称取0.1g组织，加入提取液冰浴匀浆，离心取上清。
   • 细胞样本：收集细胞后超声破碎（冰浴，功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次），离心取上清。
   • 血清/血浆：直接检测或按需稀释。
2. 酶促反应：
   • 在EP管中依次加入反应缓冲液、样本（或对照），混匀后37℃水浴10分钟。
3. 终止反应与离心：
   • 加入终止液（如三氯乙酸），混匀后离心（8000g，4℃，10分钟），取上清。
4. 显色与测定：
   • 在96孔板或比色皿中加入上清液、标准磷溶液（空白对照）及定磷剂，室温显色30分钟。
   • 在660nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线并计算酶活性。

四、结果计算

• 酶活力单位定义：
  • 血清/血浆：每小时每毫升样本中酶分解ATP产生1μmol无机磷为1个酶活力单位（U/mL）。
  • 组织/细胞：每小时每毫克蛋白或每克组织中酶分解ATP产生1μmol无机磷为1个酶活力单位（U/mg prot或U/g）。
• 计算公式：

        
            
               
               
          
        
        
            
          
  1酶活力 = [C标准 × V总 × (A测定 - A对照)] / [(A标准 - A空白) × V样 × T] 2
       
      
    

  • C标准：标准磷浓度（如0.5μmol/mL）；
  • V总：反应总体积（mL）；
  • V样：样本体积（mL）；
  • T：反应时间（小时）。

五、关键注意事项

1. 无磷环境：
   • 试剂配制需使用无磷容器（如一次性塑料器皿），避免污染。
   • 定磷剂现用现配，若颜色异常（无色或蓝色）需重新配制。
2. 样本处理：
   • 细菌/细胞需超声破碎 ，避免酶活性损失。
   • 血清/血浆样本若浑浊需离心后取上清。
3. 仪器校准：
   • 分光光度计需预热30分钟以上，蒸馏水调零。
   • 波长设置为660nm（部分试剂盒可能要求700nm）。
4. 质量控制：
   • 每次实验需同步测定标准曲线（R²≥0.99）和质控品。
   • 空白管和标准管仅需各测一管。