一、 检测原理

• 方法类型：间接竞争酶联免疫吸附法 (Indirect Competitive ELISA)。
• 核心机制：
  1. 酶标板微孔预先包被马兜铃酸偶联抗原（如AAS-BSA）。
  2. 样品中的马兜铃酸与板上包被的偶联抗原竞争结合限量的特异性抗马兜铃酸抗体。
  3. 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与一抗结合形成“包被抗原-一抗-酶标二抗”复合物。
  4. 加入TMB底物显色（蓝色），加入终止液后变为黄色。
  5. 样品OD值与马兜铃酸含量成负相关。
  6. 定量：通过标准曲线计算浓度，再乘以稀释倍数得到样品实际含量。

二、 精密度指标

• 检测范围：通常为 0.5 ng/mL ~ 32 ng/mL 或 1-150 ng/mL（依具体试剂盒而定）。
• 灵敏度（检测限）：通常 ≤ 0.5 ng/mL 或 0.3 ng/mL。
• 批内精密度 (Intra-assay)：CV% < 10%。
• 批间精密度 (Inter-assay)：CV% < 15%。
• 标准曲线相关性：r ≥ 0.998。
• 加标回收率：95% ~ 。

三、 实验前准备

1. 试剂平衡：所有试剂（标准品、抗体、酶标二抗等）从冰箱取出，置于室温(20-30℃)平衡30分钟。
2. 洗涤液配制：将20×（或25×/30×）浓缩洗涤液用蒸馏水按1:20比例稀释（如1mL浓缩液+19mL水）。若有结晶，水浴加热溶解。
3. 标准品配制：用标准品稀释液将冻干标准品进行2倍系列稀释，制备7个浓度梯度（如400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 0 ng/mL）。
4. 工作液配制：使用前10分钟，用稀释液将100×一抗和100×酶标二抗稀释成1×工作液。
5. 样品处理：
   • 血清/血浆：离心（2000-3000g，15-20分钟）取上清。
   • 组织/细胞：匀浆、离心（2000-3000g，10-20分钟）取上清。
   • 稀释：根据预实验结果，用样品稀释液将样品稀释至标准曲线范围内（常见稀释倍数为5倍）。
6. 仪器耗材：酶标仪（450nm/630nm）、移液器及枪头、洗板机（或手工洗板）、封板膜、水平振荡器、EP管、量筒。

四、 实验步骤汇总

步：加样与孵育

步：洗涤

第三步：加酶标二抗与孵育（若为竞争法）

第四步：显色

第五步：终止与读数

第六步：结果计算

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