一、 检测原理

本试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫吸附法 (Indirect Competitive ELISA)。

1. 包被：酶标板微孔预先包被25-OH VD2偶联抗原（如25-OH VD2-BSA）。
2. 竞争：样品中的25-OH VD2与板上包被的偶联抗原竞争结合限量的特异性抗25-OH VD2抗体。
3. 结合：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与一抗结合形成“包被抗原-一抗-酶标二抗”复合物。
4. 显色：加入TMB底物，酶催化显色（蓝色），加入终止液后变为黄色。
5. 测定：样品OD值与25-OH VD2含量成负相关。
6. 定量：通过标准曲线计算浓度，再乘以稀释倍数得到样品实际含量。
   （注：部分试剂盒也可能采用双抗体夹心法，此时OD值与浓度呈正相关，具体以说明书为准。）

二、 精密度指标

• 检测范围：通常为 0.5 ng/mL ~ 32 ng/mL 或 1-150 ng/mL（依具体试剂盒而定）。
• 灵敏度（检测限）：通常 ≤ 0.5 ng/mL 或 0.3 ng/mL。
• 批内精密度 (Intra-assay)：CV% < 10%。
• 批间精密度 (Inter-assay)：CV% < 15%。
• 标准曲线相关性：r ≥ 0.998。
• 加标回收率：95% ~ 。

三、 实验前准备

1. 试剂平衡：所有试剂（标准品、抗体、酶标二抗等）从2-8℃冰箱取出，置于室温（20-30℃）平衡30分钟。
2. 洗涤液配制：将20×浓缩洗涤液用蒸馏水按1:20比例稀释（如1mL浓缩液+19mL水）。若有结晶，水浴加热溶解。
3. 标准品配制：用标准品稀释液将冻干标准品进行2倍或梯度稀释，制备7个浓度梯度（如36, 18, 9, 4.5, 2.25, 1.125, 0 ng/mL）。
4. 工作液配制：使用前10分钟，用稀释液将100×一抗和100×酶标二抗稀释成1×工作液。
5. 样品处理：
   • 血清/血浆：离心（2000-3000g，15-20分钟）取上清。
   • 组织/细胞：匀浆、离心（2000-3000g，10-20分钟）取上清。
   • 稀释：根据预实验确定稀释倍数，使样品浓度落入标准曲线范围内。
6. 仪器耗材：酶标仪（450nm/630nm）、移液器及枪头、洗板机（或手工洗板）、封板膜、水平振荡器、EP管、量筒。

四、 实验步骤汇总

步：加样与孵育

步：洗涤

第三步：加酶标二抗与孵育（ 竞争法）

第四步：显色

第五步：终止与读数

第六步：结果计算

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