一、 检测原理

• 方法类型：双抗体夹心酶联免疫吸附法 (Sandwich ELISA) 或 间接竞争酶联免疫吸附法 (Indirect Competitive ELISA)。
• 核心机制（夹心法）：酶标板微孔预先包被FA特异性抗体，样品中的FA与包被抗体结合，再与HRP标记的检测抗体结合，形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物。
• 核心机制（竞争法）：样品中的FA与板上包被的FA-BSA偶联抗原竞争结合限量的特异性抗FA抗体，加入酶标二抗后形成复合物。
• 信号关系（夹心法）：样品吸光度（OD值）与FA含量成正相关。
• 信号关系（竞争法）：样品吸光度（OD值）与FA含量成负相关。
• 显色系统：TMB底物显色（蓝色），终止液终止后变为黄色。

二、 精密度指标

• 检测范围：5 ng/ml ~ 360 ng/ml 或 156 pg/ml ~ 10000 pg/ml（根据具体试剂盒而定）。
• 灵敏度（检测限）：< 0.1 nmol/L 或 5.63 ppb。
• 批内精密度 (Intra-assay)：CV% < 10%。
• 批间精密度 (Inter-assay)：CV% < 15%。
• 标准曲线相关性：r ≥ 0.99。
• 加标回收率：95% ~ 。

三、 实验前准备

1. 试剂平衡：所有试剂（标准品、抗体、酶标二抗）置于室温（20-30℃）平衡30分钟。
2. 洗涤液配制：20×浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释（如1mL浓缩液+19mL水）。
3. 标准品配制：用1×稀释液将标准品母液进行2倍系列稀释，制备所需浓度梯度（如7个浓度）。
4. 工作液配制：使用前10分钟，用1×稀释液将100×一抗和100×酶标二抗稀释成1×工作液。
5. 样品处理：
   • 血清/血浆：离心20分钟（2000-3000转/分），收集上清。
   • 组织/细胞：匀浆、离心（2000-3000转/分），收集上清。
   • 关键步骤：根据预实验确定稀释倍数，使样品浓度落入标准曲线范围内。
6. 仪器耗材：酶标仪（450nm/630nm）、移液器及枪头、洗板机、封板膜、水平振荡器、EP管、量筒。

四、 实验步骤汇总

步：加样与孵育

步：洗涤

第三步：加酶标二抗与孵育

第四步：洗涤

第五步：底物显色

第六步：终止与读数

第七步：结果计算

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