一、 检测原理

1. 方法类型：双抗体夹心酶联免疫吸附法 (Sandwich ELISA)。
2. 核心机制：
   1. 酶标板微孔预先包被特异性抗花生过敏原Ara H1抗体。
   2. 样品中的Ara H1与包被抗体结合，形成“包被抗体-Ara H1”复合物。
   3. 加入生物素标记的检测抗体，形成“包被抗体-Ara H1-生物素化检测抗体”复合物。
   4. 加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶（SA-HRP），与生物素结合。
   5. 加入TMB底物显色（蓝色），加入终止液后变为黄色。
   6. 样品OD值与Ara H1含量呈正相关。
   7. 定量：通过标准曲线计算浓度，再乘以稀释倍数得到样品实际含量。

二、 精密度指标

• 检测范围：通常为 0.5ng/mL ~ 32ng/mL 或 0.005-50 ppm（依具体试剂盒而定）。
• 灵敏度（检测限）：通常 ≤ 0.5ng/mL 或 0.0008 ppm。
• 批内精密度 (Intra-assay)：CV% < 10%（或 < 5%-8%）。
• 批间精密度 (Inter-assay)：CV% < 15%（或 < 8%）。
• 标准曲线相关性：r ≥ 0.998。
• 加标回收率：95% ~ （巧克力96±4%，冰淇淋92±5%）。
• 特异性：与Ara h 2/3交叉反应 < 0.01%，不与燕麦、小麦、大豆等交叉反应。

三、 实验前准备

1. 试剂平衡：所有试剂（标准品、抗体、酶结合物等）从冰箱取出，置于室温(20-30℃)平衡30分钟。
2. 洗涤液配制：将20×（或25×/30×）浓缩洗涤液用蒸馏水按1:20比例稀释（如1份浓缩液+19份水）。若有结晶，水浴加热溶解。
3. 标准品配制：用标准品稀释液将冻干标准品进行2倍系列稀释，制备7个浓度梯度（如32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，0ng/mL作为零浓度）。
4. 工作液配制：
   • 使用前10分钟，用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液。
   • 使用前10分钟，用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液。
5. 样品处理：
   • 血清/血浆：离心(1000-3000g, 15-20分钟)取上清。建议2倍稀释。
   • 组织/细胞：匀浆、离心(1000-3000g, 10-20分钟)取上清。
   • 食品样本：
     • 粉碎、匀浆。
     • 加入提取缓冲液（如PBS+0.5% Tween20）。
     • 60℃加热提取10分钟（巧克力需加入脱脂奶粉防止抗原遮蔽）。
     • 离心(15000g, 15分钟)取上清。
     • 根据预实验结果稀释至标准曲线范围内（常见稀释倍数为5倍或1:4）。
   • 烘焙食品：添加2M尿素解聚聚集体。
6. 仪器耗材：酶标仪（450nm/630nm）、移液器及枪头、洗板机（或手工洗板）、封板膜、水平振荡器、EP管、量筒。

四、 实验步骤汇总

步：加样与孵育

步：洗涤

第三步：酶标孵育（若为两步法）
若为一步法（即抗体与酶标已混合），此步省略。

第四步：显色

第五步：终止与读数

第六步：结果计算

相关产品如下：