一、 检测原理

• 方法类型：间接竞争酶联免疫吸附法 (Indirect Competitive ELISA)
• 核心机制：样品中的BHT与板上包被的BHT-BSA偶联抗原竞争结合限量的特异性抗BHT抗体。
• 信号关系：样品吸光度（OD值）与BHT含量成负相关。
• 显色系统：TMB底物显色（蓝色），终止液终止后变为黄色。

二、 精密度指标

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• 检测范围：50 ppb ~ 3200 ppb (或 0.05 mg/kg ~ 3.2 mg/kg)
• 灵敏度（检测限）：50 ppb (0.05 mg/kg)
• 批内精密度 (Intra-assay)：CV% < 10%
• 批间精密度 (Inter-assay)：CV% < 15%
• 标准曲线相关性：r ≥ 0.998
• 加标回收率：95% ~

三、 实验前准备

1. 试剂平衡：所有试剂（标准品、抗体、酶标二抗）置于室温（20-30℃）平衡30分钟。
2. 洗涤液配制：20×浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释（如1mL浓缩液+19mL水）。
3. 标准品配制：用1×稀释液将1000 μg/mL标准品母液进行2倍系列稀释，制备0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL共7个浓度梯度。
4. 工作液配制：使用前10分钟，用1×稀释液将100×一抗和100×酶标二抗稀释成1×工作液。
5. 样品处理：
   • 根据样本类型（谷物、油脂、饲料等）进行粉碎、提取、离心。
   • 关键步骤：根据预实验确定稀释倍数，使样品浓度落入标准曲线范围内（建议稀释1倍以上）。
6. 仪器耗材：酶标仪（450nm/630nm）、移液器及枪头、洗板机、封板膜、水平振荡器、EP管、量筒。

四、 实验步骤汇总

步：加样与孵育

步：洗涤

第三步：加酶标二抗与孵育

第四步：洗涤

第五步：底物显色

第六步：终止与读数

第七步：结果计算