一、产品信息

• 通用名称：4-羟基壬烯酸（4-HNE）ELISA试剂盒
• 用途：本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液及其他相关生物液体样本中4-羟基壬烯酸（4-HNE）的含量。

二、检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被4-羟基壬烯酸（4-HNE）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的4-羟基壬烯酸（4-HNE）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中4-羟基壬烯酸（4-HNE）的浓度。

三、试剂盒组成

• 微孔酶标板
• 标准品
• 样本稀释液
• 检测抗体-HRP
• 20×洗涤缓冲液
• 底物A
• 底物B
• 终止液
• 封板膜
• 说明书

四、样本收集、处理及保存方法

• 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可。或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
• 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测。或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
• 组织匀浆：用预冷的PBS（0.01M，pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液。称重后将组织剪碎，将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。 将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
• 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测。或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
• 其他生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

五、检测步骤

1. 试剂准备：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，此为正常现象，可水浴或者培养箱中使结晶完全溶解后再配置洗涤液（加热温度不要超过40℃）。将20×洗涤缓冲液用蒸馏水按1:20稀释后备用。
2. 加样：分别设标准孔、待测样本孔和空白孔。标准孔各加不同浓度的标准品50μL；待测样本孔中先加样本稀释液40μL，然后再加待测样本10μL（样本最终稀释度为5倍）；空白孔不加。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟（具体时间根据试剂盒说明书可能有所不同）。
4. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
5. 加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
6. 温育：操作同步骤3。
7. 洗涤：操作同步骤4。
8. 显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟（具体时间根据试剂盒说明书可能有所不同）。
9. 终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
10. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

六、结果计算

• 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

七、注意事项

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间 控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线， 做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔 孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请 乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
8. 所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。